بیولوژی سلولی و ملکولی

(ادامه مطلب در شماره بعد...)(قسمت اول) (Originally published in PWSA’s The Gathered View by Linda Keder, former editor, March-May 2000. Revised and updated in July 2004 with the assistance of Merlin G. Butler, M.D. Ph.D., Chair, PWSA-USA Scientific Advisory Board.) When the medical world first learned about Prader-Willi syndrome in 1956, doctors had no idea what caused people to have this collection of features and problems that we now know as PWS. In 1981, Dr. David Ledbetter and his colleagues reported a first breakthrough discovery: Many people with PWS that they studied had the same segment of genes missing from one of their chromosomes. They had discovered the deletion on chromosome 15 that accounts for about 70 percent of the cases of PWS. Since then, researchers have made a series of other important discoveries about the genes involved in Prader-Willi syndrome. Thanks to their perseverance, we now know much more about the several genetic forms of this complex disorder, and we have genetic tests that can confirm nearly every case. Chromosomes and Genes: The Basics To understand the genetics of PWS, it helps to have a basic understanding of chromosomes and genes. Chromosomes are tiny structures that are present in nearly every cell of our bodies. They are the packages of genes we inherit from our parents. Genes contain all the detailed instructions our bodies need to grow, develop, and function properly—our DNA. Specific genes direct our cells to produce proteins, enzymes, and other essential substances. Each of our many genes is located on a specific chromosome. Most of our body’s cells contain 46 chromosomes—23 inherited from our mother and 23 from our father. (Egg and sperm cells normally contain just 23 chromosomes, because those are the cells that join in conception and provide the baby the right number of chromosomes.) Twenty-two of the chromosome pairs are labeled with a number based on their size (chromosome 1 is the largest pair, and chromosome 22 is nearly the smallest), and the two chromosomes in each numbered pair contain the same genes (one set from mother and one from father). The changes that cause Prader-Willi syndrome occur on the pair known as chromosome 15. The 23rd chromosome pair is designated as the sex chromosome pair This pair determines the baby’s sex: XX for a girl, XY for a boy. Changes or errors in genes and chromosomes are common in the formation of egg and sperm cells. Some of these genetic changes will have no effect when a baby is conceived; some will cause a miscarriage; and some, like those in Prader-Willi syndrome, will cause significant differences in how the baby develops and functions. While many genetic disorders are caused by a change in a single gene and can be passed down from parent to child, PWS is more complicated. Some of the important genetic characteristics of PWS identified through research are: • More than one gene is involved in PWS, and these genes are near each other in a small area of what is called the “long arm” of chromosome 15—in a region labeled 15q11-q13. Scientists still don’t know exactly how many genes and which specific ones are involved. • The critical genes must come from the baby’s father in order to function properly; the mother’s genes in this area are “turned off” through a rare phenomenon called “genomic imprinting.” • There are at least three different chromosome errors that can keep these key genes from working normally, and all result in the child having Prader-Willi syndrome. • The two most common errors that cause PWS can occur in any conception—in other words, PWS is not usually an inherited condition; it just happens. In very rare cases, however, parents may have a 50-percent chance of having another child with PWS. The Role of Genomic Imprinting During the early 1980s, scientists puzzled over why some people who seemed to have PWS did not have the chromosome 15 deletion, and why some people with the chromosome 15 deletion seemed to have a different condition from PWS. Dr. Merlin Butler and colleagues began unraveling the puzzle when they reported in 1983 that the chromosome 15 deletion in PWS was on the father’s chromosome. The next breakthrough came in 1989, when Dr. Robert Nicholls and fellow researchers announced their discovery that PWS is an example of genetic or genomic imprinting, a process well known in plant genetics but not previously identified in humans. This means that some of our genes have to come from a particular parent to work normally. These rare genes are said to be “imprinted,” or have the ability to be turned off or on, depending on which parent contributed the gene. In what scientists call the “Prader-Willi region” of chromosome 15 (the area where the deletion occurs), there are genes that must come from the baby’s father that are active, or “expressed,” in order to work. These genes are not active or expressed on the chromosome 15 inherited from the mother because the mother’s imprint turns them off. In Prader-Willi syndrome, these critical genes are either missing (deleted) from the father’s chromosome 15, functioning improperly because of an imprinting defect, or the entire chromosome 15 from the father is missing and both chromosome 15s come from the mother. (See The Three Genetic Forms of PWS for more detail on each of these errors.) When a deletion of chromosome 15q11-q13 region is found on the mother’s chromosome 15, the result is an entirely different syndrome called Angelman syndrome (AS). That is because there is also one gene in the Prader-Willi region that is imprinted, or turned off, on the father’s chromosome 15; people who lack this gene from their mother have AS rather than PWS. This discovery explained the mysterious cases of people who had a chromosome 15 deletion but did not have the characteristics of PWS—their deletion was on the chromosome 15 that came from the mother. Because the genetic errors happen in the same section of chromosome 15, PWS and AS are sometimes called “sister” syndromes even though the disorders have few features in common.

قسمت چهارم ) قسمت آخر) بحث: نیتریک اکساید مولکولی بــا اهمیت بیولـوژیک بالاست و نقش مهم آن را در فیزیولوژی اسپــرم ماننـــد کموتاکسی اسپرم، حرکت اسپرم، اسپرماتوژنز و غیره به اثبات رسیده است (9،14). مطالعات نشان می دهند که نیتریک اکساید اثرات خود را از طریق یک مسیر داخل سلولی که منجر به فعال شدن آنزیم گوانیلات سیکلاز و تولید cGMP می شود، ایفاء می کند (17،18). این مسیرهای سیگنال دهنده داخل سلولی مرتبط با نیتریک اکساید، در بسیاری از سلول های پیکری و سلولهای جنسی مانند اسپرم یافت شده اند (19). البته مطالعاتی هم حاکی از آن است که نیتریک اکساید اثرات خود را از طریق مسیرهای غیر وابسته به cGMP نیز انجام می دهد (20). در مطالعه حاضر، GSNO به عنوان دهنده نیتریک اکساید، در محیط پیرامون اسپرم با تولید نیتریک اکساید موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپرم بعد از 90 دقیقه گردید. Hassanpour و همکاران نیز که از SNP به عنوان دهنده نیتریک اکساید استفاده کرده بودند، توانستد موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپرم شوند (10). در همین مطالعه، نشان داده شد که مهار آنزیم سازنده نیتریک اکساید (توسط L-NAME) می تواند حرکت اسپرم را به طور چشمگیری کاهش دهد (10). به هر حال مطالعات مذکور تائیدی بر نتیجه بدست آمده در این تحقیق است اگرچه زمان اثر GSNO نسبت به مواد مشابه در مطالعات قبلی متفاوت بوده که حاکی از ویژگی این ماده و مقدار متفاوت تولید نیتریک اکساید توسط آن، در محیط اسپرم می تواند باشد.در بخش دیگری از این تحقیق، 8-Br-cGMP به عنوان یک آنالوگ cGMP قابل نفوذ به داخل سلول، مورد استفاده قرار گرفت که موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپرم شد و برای اولین بار نشان داده شد که cGMP به عنوان پیامبر ثانویه در حرکت پیشرونده اسپرم انسـان نقش دارد. جهت تائیـــد این نتیجــه، از ODQ به عنوان مهارکننده آنزیم سازنده cGMP (گوانیلات سیکلاز محلول) نیز استفاده شد. هنگامی که ماده اخیر به محیط اسپرم افزوده شد، حرکات اسپرم را کاهش داد که این هم دلالت بر ساخته شدن cGMP در داخل اسپرم و مشارکت آن در مکانیسم حرکت پیشرونده اسپرم دارد. البته Burger و همکاران و نیز Lefivre و همکاران در مطالعات خود نیز با مهار آنزیم فسفودی استراز سلول (آنزیم مذکور cGMP سلول را کاهش می دهد) توانستند فعالیت اسپرم را افزایش دهند که به طور غیر مستقیم حاکی از دخالت cGMP در تحرک اسپرم بوده است (21،22). اطلاعات متضادی نیز در این رابطه منتشر شده است که نشان می دهد مهار آنزیم فسفودی استراز توسط Sildenafil تغییر قابل توجه ای را در حرکت اسپرم ایجاد نمی کند (23،24).با توجه به تحقيقات گذشته نکته قابل توجه در مورد ODQ، این است که این ماده اثر مهاری خود را، بر آنزیم گوانیلات سیکلازی که وابسته به نیتریک اکساید است، اعمال می کند (25). با توجه به این موضوع و با تکیه بر اثر مهاری ODQ بر حرکت پیشرونده اسپرم، می توان بر اثر نیتریک اکساید در حرکت اسپرم از طریق فعال کردن گوانیلات سیکلاز و تولید cGMP صحه گذارد. جهت تائید این مطلب، به محیط حاوی GSNO، ماده ODQ نیز اضافه گردید که موجب کاهش اثر تحریکی GSNOدر تحرک اسپرم شد که می توان چنین استنباط کرد که نیتریک اکساید با افزایش فعالیت آنزیم گوانیلات سیکلاز در اسپرم، موجب کنترل حرکت پیشرونده آن می شود. با توجه به این مطالعه که نشان دهنده دخالت نیتریک اکسید در حرکت طبیعی اسپرم است پیشنهاد می گردد در مطالعه بر روی علل ناباروری های مربوط به عدم تحرک اسپرم نیتریک اکسید و عوامل وابسته به آن نیز مورد توجه قرار گیرد. نتیجه گیری: نیتریک اکساید کنترل کننده حرکت پیشرونده اسپرم از طریق فعال کردن آنزیم گوانیلات سیکلاز و ساختن cGMP در انسان است. محقق : دکتر حسین حسن پور*1 *استادیار گروه فیزیولوژی- دانشگاه شهرکرد.

قسمت سوم: (ادامه مطلب در شماره آینده..........) روش بررسی: در این مطالعه تجربی، از افراد سالمی که جهت ارزیابی باروری به بیمارستان S. Anna در تورین ایتالیا مراجعه کرده بودند (در پائیز و زمستان 1384)، تعداد 20 نمونه منی تهیه گردید. بعد از قرار دادن منی به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 37 درجه سانتیگراد جهت تبدیل شدن آن به حالت مایع، نمونه ها با استفاده از سیستم کامپیوتری آنالیز کننده اسپرم CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) مطابق با دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی، مورد ارزیابی اولیه قرار می گرفتند (16). تنها نمونه هائی که از پارامتر های طبیعی (غلظتی بیشتر از ml/10620 و حرکت پیشرونده بالاتر از 50%) برخوردار بودند، در تحقیق مورد استفاده قرار می گرفتند.اسپرم های پر تحرک با روش شناور سازی (Swim up) و با استفاده از محیط اصلاح شده مایع توبولی انسان HTF (Human Tubal Fluid) که از شرکت Irvine Sientific خریداری شده بودند جدا گردیدند. بدین صورت که در یک لوله آزمایش ته مخروطی، مقدار 1 میلی لیتر محیط اصلاح شده HTF ریخته، سپس 1 میلی لیتر از منی به ته لوله اضافه می شد. حدود 60 دقیقه در ºC37 با زاویه º45 قرار داده، بعد از زمان مذکور، 5/0 میلی لیتر از مایع روئی لوله به یک میکروتیوب 5/1 میلی لیتری منتقل می گردید. جهت شستشوی اسپرم های بدست آمده، حدود 1 میلی لیتر از محیط اصلاح شده HTF به میکروتیوب اضافه شده و در دور g 500 سانتریفوژ گردید سپس مایع روئی دور ریخته شد. اسپرمهای بدست آمده بعد از شناور سازی، دارای حداقل سلول های گرد (اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید و گلبولهای سفید) (کمتر از ml/1061) بودند.سوسپانسیونی از اسپرم و محیـــط اصلاح شـــده HTF به میزان 200 میکرولیتر محتوی حدود 1062 اسپــــرم در پنج تیمـــار از هـــر نمونه تهیـــه و در درجـــه حرارت 37 درجــه سانتیگراد به مدت 90 دقیقه در تیمــار اول در معرض μM150 GSNO (S-nitrosoglutathion)، تیمار دوم، μM 100 ODQ (α]quinoxalin-1-one- [4,3 oxadiozolo 1H-[1,2,4 ])، mM 150 8-bromo-cGMP تیمار سوم (ساخت شرکت Sigma) و در تیمار چهارم در معرض GSNO+ODQ قرار داده شد (مقادیر ذکر شده مربوط به هر ماده، با توجه به تست اولیه دوزهای مختلف این مواد بر روی اسپرم، انتخاب شد). در تیمار پنجم سوسپانسیونی از اسپرم و محیط اصلاح شده HTF بدون مواد مذکور (حجم مساوی از HTF جایگزین مواد مذکور می شد) به عنوان گروه کنترل، آماده شده و اسپرمهای معلق در آن همانند نمونه های دیگر مورد ارزیابی قرار گرفت.حرکت پیشرونده اسپرم که شامل مجموعه حرکات سریع و آهسته متمایل به جلو بود با استفاده از سیستم CASA (Color Sperm Analysis System,WLJY-900, China) در شرایط زیر مورد ارزیابی قرار گرفت: سرعت تصویر برداری دستگاه، 20 زمینه در ثانیه، زمان آنالیز در هر زمینه، کمتر از 15 ثانیه، سرعت اسپرم های قابل آنالیز،µm/s 180-0، تعداد میدان میکروسکوپی مورد ارزیابی، 6 میدان برای هر نمونه و درشت نمائی عدسی مورد استفاده x200. در این تحقیق از لام مخصوص Mackler با عمق m 20 جهت آنالیز اسپرمها استفاده گردید. آنالیز حرکتی اسپرمها در فواصل زمانی 0، 30، 60 و 90 دقیقه برای هر یک از نمونه های تحت آزمایش و کنترل انجام می گرفت. داده ها با استفاده از آزمونهای آماری t تجزیه و تحلیل گردید. یافته ها: یافته های این مطالعه نشـــان می دهد که GSNO در غلظت μM 150 موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپـــرم ها بعد از 60 دقیقه گردیـــد که البته تنها در زمان 90 دقیقــــه این افزایش (1/4%) نسبت به نمونه کنترل معنی دار بود (05/0p<). 8-Br-cGMP در غلظت mM 150، در زمان های 60 و 90 دقیقه موجب افزایش حرکت پیشرونـــده اسپـــرم ها شد که تنهـــا در دقیقه 60 این افزایش (4%) معنی دار بود (05/0p<). قـــرار دادن ODQ با غلظت μM 100 به تنهائی و یا همــراه با μM150GSNO در محیط حـــاوی اسپرم، مـــوجب کاهـــش در حــرکت پیشـــرونده اسپـــرم ها زمان (دقیقه) نمودار شماره 1: اثرات ODQ، GSNO و 8-Br-cGMP و ODQ+GSNO بر حرکت پیشرونده اسپرم در زمانهای مختلف * 05/0p< نسبت به گروه کنترل. 20n= GSNO= S-nitrosoglutathione 8-Br-cGMP= 8-Brom-cyclic Guanosine Mono Phosphate (α]quinoxalin-1-one- [4,3 oxadiozolo 1H-[1,2,4]) ODQ= شد. بدین صورت که، ODQ به میزان 7/10 درصد در دقیقه 30، 2/11 درصد در دقیقــه 60 و 2/12 درصد در دقیقه 90 حرکت پیشرونده اسپرم را نسبت به گروه کنترل کاهش داد (05/0p<) و ODQ+GSNO نیز موجب کاهش در حرکت پیشرونده اسپرم به میزان 7/9 درصد، 8/10 درصد و 9/9 درصد به ترتیب در دقایق 30، 60 و 90 نسبت به گروه کنترل شد (05/0p<). البته باید توجه داشت که دو ماده ODQ و GSNO با یکدیگر، حرکت پیشرونده اسپرمها را به میزان کمتری کاهش دادند (نمودار شماره 1). محقق : دکتر حسین حسن پور*1 *استادیار گروه فیزیولوژی- دانشگاه شهرکرد.

قسمت سوم: (ادامه مطلب در شماره آینده..........) روش بررسی: در این مطالعه تجربی، از افراد سالمی که جهت ارزیابی باروری به بیمارستان S. Anna در تورین ایتالیا مراجعه کرده بودند (در پائیز و زمستان 1384)، تعداد 20 نمونه منی تهیه گردید. بعد از قرار دادن منی به مدت 30 دقیقه در درجه حرارت 37 درجه سانتیگراد جهت تبدیل شدن آن به حالت مایع، نمونه ها با استفاده از سیستم کامپیوتری آنالیز کننده اسپرم CASA (Computer-Aided Sperm Analysis) مطابق با دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی، مورد ارزیابی اولیه قرار می گرفتند (16). تنها نمونه هائی که از پارامتر های طبیعی (غلظتی بیشتر از ml/10620 و حرکت پیشرونده بالاتر از 50%) برخوردار بودند، در تحقیق مورد استفاده قرار می گرفتند.اسپرم های پر تحرک با روش شناور سازی (Swim up) و با استفاده از محیط اصلاح شده مایع توبولی انسان HTF (Human Tubal Fluid) که از شرکت Irvine Sientific خریداری شده بودند جدا گردیدند. بدین صورت که در یک لوله آزمایش ته مخروطی، مقدار 1 میلی لیتر محیط اصلاح شده HTF ریخته، سپس 1 میلی لیتر از منی به ته لوله اضافه می شد. حدود 60 دقیقه در ºC37 با زاویه º45 قرار داده، بعد از زمان مذکور، 5/0 میلی لیتر از مایع روئی لوله به یک میکروتیوب 5/1 میلی لیتری منتقل می گردید. جهت شستشوی اسپرم های بدست آمده، حدود 1 میلی لیتر از محیط اصلاح شده HTF به میکروتیوب اضافه شده و در دور g 500 سانتریفوژ گردید سپس مایع روئی دور ریخته شد. اسپرمهای بدست آمده بعد از شناور سازی، دارای حداقل سلول های گرد (اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید و گلبولهای سفید) (کمتر از ml/1061) بودند.سوسپانسیونی از اسپرم و محیـــط اصلاح شـــده HTF به میزان 200 میکرولیتر محتوی حدود 1062 اسپــــرم در پنج تیمـــار از هـــر نمونه تهیـــه و در درجـــه حرارت 37 درجــه سانتیگراد به مدت 90 دقیقه در تیمــار اول در معرض μM150 GSNO (S-nitrosoglutathion)، تیمار دوم، μM 100 ODQ (α]quinoxalin-1-one- [4,3 oxadiozolo 1H-[1,2,4 ])، mM 150 8-bromo-cGMP تیمار سوم (ساخت شرکت Sigma) و در تیمار چهارم در معرض GSNO+ODQ قرار داده شد (مقادیر ذکر شده مربوط به هر ماده، با توجه به تست اولیه دوزهای مختلف این مواد بر روی اسپرم، انتخاب شد). در تیمار پنجم سوسپانسیونی از اسپرم و محیط اصلاح شده HTF بدون مواد مذکور (حجم مساوی از HTF جایگزین مواد مذکور می شد) به عنوان گروه کنترل، آماده شده و اسپرمهای معلق در آن همانند نمونه های دیگر مورد ارزیابی قرار گرفت.حرکت پیشرونده اسپرم که شامل مجموعه حرکات سریع و آهسته متمایل به جلو بود با استفاده از سیستم CASA (Color Sperm Analysis System,WLJY-900, China) در شرایط زیر مورد ارزیابی قرار گرفت: سرعت تصویر برداری دستگاه، 20 زمینه در ثانیه، زمان آنالیز در هر زمینه، کمتر از 15 ثانیه، سرعت اسپرم های قابل آنالیز،µm/s 180-0، تعداد میدان میکروسکوپی مورد ارزیابی، 6 میدان برای هر نمونه و درشت نمائی عدسی مورد استفاده x200. در این تحقیق از لام مخصوص Mackler با عمق m 20 جهت آنالیز اسپرمها استفاده گردید. آنالیز حرکتی اسپرمها در فواصل زمانی 0، 30، 60 و 90 دقیقه برای هر یک از نمونه های تحت آزمایش و کنترل انجام می گرفت. داده ها با استفاده از آزمونهای آماری t تجزیه و تحلیل گردید. یافته ها: یافته های این مطالعه نشـــان می دهد که GSNO در غلظت μM 150 موجب افزایش حرکت پیشرونده اسپـــرم ها بعد از 60 دقیقه گردیـــد که البته تنها در زمان 90 دقیقــــه این افزایش (1/4%) نسبت به نمونه کنترل معنی دار بود (05/0p<). 8-Br-cGMP در غلظت mM 150، در زمان های 60 و 90 دقیقه موجب افزایش حرکت پیشرونـــده اسپـــرم ها شد که تنهـــا در دقیقه 60 این افزایش (4%) معنی دار بود (05/0p<). قـــرار دادن ODQ با غلظت μM 100 به تنهائی و یا همــراه با μM150GSNO در محیط حـــاوی اسپرم، مـــوجب کاهـــش در حــرکت پیشـــرونده اسپـــرم ها زمان (دقیقه) نمودار شماره 1: اثرات ODQ، GSNO و 8-Br-cGMP و ODQ+GSNO بر حرکت پیشرونده اسپرم در زمانهای مختلف * 05/0p< نسبت به گروه کنترل. 20n= GSNO= S-nitrosoglutathione 8-Br-cGMP= 8-Brom-cyclic Guanosine Mono Phosphate (α]quinoxalin-1-one- [4,3 oxadiozolo 1H-[1,2,4]) ODQ= شد. بدین صورت که، ODQ به میزان 7/10 درصد در دقیقه 30، 2/11 درصد در دقیقــه 60 و 2/12 درصد در دقیقه 90 حرکت پیشرونده اسپرم را نسبت به گروه کنترل کاهش داد (05/0p<) و ODQ+GSNO نیز موجب کاهش در حرکت پیشرونده اسپرم به میزان 7/9 درصد، 8/10 درصد و 9/9 درصد به ترتیب در دقایق 30، 60 و 90 نسبت به گروه کنترل شد (05/0p<). البته باید توجه داشت که دو ماده ODQ و GSNO با یکدیگر، حرکت پیشرونده اسپرمها را به میزان کمتری کاهش دادند (نمودار شماره 1). محقق : دکتر حسین حسن پور*1 *استادیار گروه فیزیولوژی- دانشگاه شهرکرد.